TITER ANTIBODI VIRUS AVIAN INFLUENZA PD UNGGAS

DETEKSI TITER ANTIBODI TERHADAP VIRUS AVIAN INFLUENZA DENGAN METODE UJI HAEMAGLUTINATION DAN HAEMAGLUTINATION INHIBITION

1.       Tujuan               : Menjamin deteksi dan penghitungan titer antibodi terhadap virus Avian Influenza pada unggas dilaksanakan dengan benar 2.    Ruang lingkup     :  Deteksi Avian Influenza secara serologi pada serum  unggas 3.Acuan                      :  PM elemen 5.4 4.     Bahan   4.1.   Larutan PBS pH 7,0-7,2, cara pembuatan : a.    Timbang bahan-bahan dengan komposisi sebagai berikut : §  NaCl             : 8,0 gr §  KCl               : 0,2 gr §  Na2HPO4       : 1,15 gr §  KH2PO4            : 0,2 gr §  Aquadest      : 1000 ml b.    Campurkan bahan-bahan tersebut dalam erlenmeyer kemudian homogenkan dengan plate stirrer. c.    Larutan disterilkan dengan autoclave pada suhu 121º C selama 20 menit. d.    Ukur PH PBS dengan PH meter, jika terlalu asam tambahkan NaOH. Terlalu basa tambahkan HCl. e.    Catatan : Larutan PBS pH 7,0 – 7,2 dapat diperoleh dengan melarutkan 1 tablet PBS pH 7,0 – 7,2 dalam 100 ml aquadest steril. 4.2.  Larutan Alseiver, cara pembuatan: a.    Timbang bahan-bahan dengan komposisi sebagai berikut : § NaCl                           : 4,2 gr § Dextrose                    : 20,5 gr § Sodium Citrat                 : 8 gr § Citric acid                         : 0,55 gr § Aquadest                    : 1000 ml b.    Campurkan bahan-bahan tersebut dalam erlenmeyer kemudian homogenkan dengan magnetic plate stirrer. c.    Larutan disterilkan dengan autoclave pada suhu 121º C selama 20 menit. .

DETEKSI TITER ANTIBODI TERHADAP VIRUS AVIAN INFLUENZA DENGAN METODE UJI HAEMAGLUTINATION DAN HAEMAGLUTINATION INHIBITION

4.3.  Sel Darah Merah (SDM) Ayam Specific Antibodi Negatif (SAN) 1% A.    Pembuatan suspensi  10% SDM ayam SAN. Ambil darah ayam SAN menggunakan spuit 23 G dan masukkan kedalam tabung sentrifus dan tambahkan cairan anti koagulansia (Larutan Alseiver) dengan perbandingan 1:1. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500 rpm. Buang supernatan (Larutan Alseiver) Cuci darah tersebut dengan phosphate buffered saline (PBS) yaitu dengan cara : §  Tambahkan PBS ke dalam suspensi SDM  tersebut secukupnya sampai tabung sentrifus hampir terisi penuh, kemudian kocok pelan-pelan dengan menggunakan pipet Pasteur. §  Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500 rpm. §  Buang PBS dan lapisan lekosit (lapisan berwarna kelabu terletak diatas permukaan SDM) dengan jalan mengisapnya dengan pipet Pasteur. §  Ulangi tahap 1, 2, dan 3 sebanyak 4 kali atau sampai lapisan lekosit habis terbuang dan PBS pencuci tidak berwarna merah. Buatlah dari endapan SDM tersebut suspensi SDM 10%, yaitu dengan  menambah PBS 9 kali banyaknya endapan SDM. B.   Penyiapan suspensi  SDM ayam SAN 1% a.    Aduk suspensi SDM ayam SAN 10% lalu ambil 1 ml, pindahkan  ke dalam tabung reaksi b.    Tambahkan PBS sebanyak 9 ml c.    Kocok pelan-pelan sampai homogen (tercampur rata) Catatan : Suspensi darah ini harus selalu dikocok terlebih dahulu sebelum dipakai.       4.3.  Cara membuat titer antigen  4 HAU a.    Pengenceran yang diperlukan          =          Titer Antigen Hasil Uji HA                                                                                            22 Misal dari uji HA dihasilkan titer Antigen sebesar 24 (16 HAU) =         24   22 =         22                                                  =        4 X b.      Untuk mendapatkan Titer Antigen 4 HAU pada contoh diatas adalah dengan mengencerkan 1 bagian Antigen dengan titer 24  dalam  3 bagian larutan PBS.

DETEKSI TITER ANTIBODI TERHADAP VIRUS AVIAN INFLUENZA DENGAN METODE UJI HAEMAGLUTINATION DAN HAEMAGLUTINATION INHIBITION

5.      Alat a)    Timbangan, b)    Erlenmeyer, c)    Autoclave, d)    Cawan Petri, e)    Mikroplate dasar V, f)     Tabung reaksi; g)    pH meter, h)    timer, i)      magnetic plate stirrer, j)      Sentrifus, k)    pengocok tabung (vortex), l)      Mikropipet 5-50 µl, m)  Multichannel mikropipet 5-50 µl, n)    Reagent reservoir, o)    lemari steril (clean bench), p)    lemari pendingin (refrigerator). 6.      Prosedur Kerja A.         Uji Haemaglutination a.    Menyiapkan peralatan dan bahan yang akan digunakan. b.    Membuat larutan Alseiver. c.    Membuat isotonik PBS ph 7,0-7,2 d.    Membuat Larutan Sel Darah Merah (SDM) Ayam Specific Antibodi Negatif (SAN) 1%. e.    Menyiapkan mikroplate dasar V. f.     Proses uji HA dilakukan secara duplo (baris A dan B) g.    Masukkan 25 µl larutan PBS dengan menggunakan multichannel mikropipet kedalam setiap sumur pada baris A dan B.  h.    Tambahkan 25 µl antigen dengan menggunakan mikropipet kedalam sumur  pertama baris A dan B. i.      Homogenkan campuran larutan PBS dan antigen dengan menggunakan multichannel mikropipet, kemudian pindahkan 25 µl kedalam sumur kedua. j.      Lakukan hal serupa terhadap sumur-sumur berikutnya untuk memperoleh pengenceran serial hingga sumur kesebelas. Buang 25 µl campuran antigen dan PBS dari sumur 11. Sumur 12 digunakan sebagai kontrol SDM. k.    Tambahkan 25 µl larutan PBS dengan menggunakan multichannel mikropipet kedalam setiap sumur baris A dan B. l.      Tambahkan 25 µl larutan SDM 1 % dengan menggunakan multichannel mikropipet kedalam setiap sumur baris A dan B. m.   Mix mikroplate perlahan dengan mikroshaker kemudian inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar.

DETEKSI TITER ANTIBODI TERHADAP VIRUS AVIAN INFLUENZA DENGAN METODE UJI HAEMAGLUTINATION DAN HAEMAGLUTINATION INHIBITION

n.    Pembacaan hasil : §  Pada kontrol SDM (sumur 12) terjadi endapan sel darah merah terlihat seperti air mata jatuh. Hasil Positif Antigen Virus AI yang menunjukkan adanya hemaglutinasi  ditandai dengan adanya bentuk seperti pasir tersebar. §  Titer Antigen AI ditentukan pada pengenceran tertinggi dari antigen yang masih mampu mengaglutinasi SDM pada baris A dan B. §  Misal : aglutinasi pada baris A dan B terjadi pada sumur no. 1 - 4 maka titer antigen adalah 24 atau 16 Hemaglutinasi Unit ( HAU)]. Catatan :     §  Antigen untuk uji HI minimal 4 HAU. §  Apabila didapatkan perbedaan hasil titer dari baris A dan B maka harus dilakukan pengulangan pengujian. B.       Uji Haemaglutination-inhibition a.    Menyiapkan peralatan dan bahan yang akan digunakan. b.    Menyiapkan sampel serum yang akan diuji. c.    Serum di-inaktivasi di waterbath dengan suhu 56° C selama 30 menit. d.    Menyiapkan mikroplate dasar V, baris A digunakan untuk kontrol positif dan baris B digunakan untuk sampel 1, baris C untuk sampel 2 dan seterusnya sesuai dengan jumlah sampel yang akan diuji. e.    Masukkan 25 µl larutan PBS dengan menggunakan mikropipet kedalam setiap sumur baris A, B, C dan seterusnya sesuai dengan jumlah sampel yang akan diuji. f.     Tambahkan 25 µl serum standar Antibodi AI dengan menggunakan mikropipet kedalam sumur  pertama baris A. g.    Tambahkan 25 µl serum sampel dengan menggunakan mikropipet kedalam sumur  pertama baris B untuk sampel no. 1, kemudian pada sumur pertama baris C untuk sampel no. 2 dan seterusnya sesuai dengan jumlah sampel yang akan diuji. h.    Homogenkan campuran larutan PBS dengan serum standar dan PBS dengan serum sampel menggunakan Mutichannel mikropipet, kemudian pindahkan 25 µl kedalam sumur kedua masing – masing baris.
DETEKSI TITER ANTIBODI TERHADAP VIRUS AVIAN INFLUENZA DENGAN METODE UJI HAEMAGLUTINATION DAN HAEMAGLUTINATION INHIBITION

i.Lakukan hal serupa terhadap sumur-sumur berikutnya untuk memperoleh pengenceran serial hingga sumur kesebelas. Buang 25 µl campuaran Antigen dan PBS dari sumur 11. Sumur 12 digunakan sebagai kontrol SDM. j.Tambahkan 25 µl Antigen 4 HAU dengan menggunakan multichannel mikropipet pada setiap sumur disemua baris yang digunakan kecuali sumur 12. k.    Mix Mikroplate perlahan dengan mikroshaker kemudian inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. l.Tambahkan 25 µl larutan SDM 1 % dengan menggunakan multichannel mikropipet pada setiap sumur di semua baris yang digunakan. m.   Mix Mikroplate perlahan dengan mikroshaker kemudian inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. n.    Pembacaan Hasil : §    Pada kontrol SDM (sumur 12) terjadi endapan sel darah merah terlihat seperti air mata jatuh (tear shaped streaming).   Serum yang positif mengandung antibodi virus AI menunjukkan hemaglutination inhibition ditandai dengan adanya endapan sel darah merah seperti pada kontrol SDM (sumur 12). §    Titer Antibodi AI pada serum ditentukan dari pengenceran serum tertinggi yang masih mampu menghambat antigen 4 HAU untuk mengaglutinasi SDM.  Misal hambatan aglutinasi terjadi pada sumur 1 – 4 maka titer antibodinya adalah 24 . 7.      Referensi OIE 2005  Anonim,  1999. Manual Standar Metode Diagnosa Laboratorium  Kesehatan Hewan, Direktorat Bina Kesehatan Hewan Dirjen Peternakan, Deptan.